Новости  Акты  Бланки  Договор  Документы  Правила сайта  Контакты
 Топ 10 сегодня Топ 10 сегодня 
  
19.11.2015

Семакс 1 процентный инструкция

Диссертация на тему «Механизмы действия пептида Семакс на центральную нервную систему: роль нейротрофинов» автореферат по специальности ВАК 03. Связывание Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы 2. Деградация Семакса в присутствии плазматических мембран, культивируемых нейронов и нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы 3. Влияние Семакса на пролиферацию нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы in vitro 4. Влияние Семакса на выживаемость культивируемых нейронов базальных ядер переднего мозга крысы 5. Влияние Семакса на экспрессию мРНК BDNF и NGF в культуре клеток нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы 6. Влияние Семакса на уровень BDNF в базальных ядрах переднего мозга крысы семакс 1 процентный инструкция vivo 7. Влияние Семакса на экспрессию BDNF в гиппокампе, мозжечке и коре больших полушарий мозга крысы in vivo 8. Влияние Семакса на экспрессию TrkB в гиппокампе крысы 88 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91 ВЫВОДЫ 93 Список опубликованных работ по теме диссертации 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96 БЛАГОДАРНОСТИ СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ 6-OHDA - 6-гидроксидофамин BDNF - brain derived neurotrophic factor, нейротрофический фактор мозга bp - пар нуклеотидов, п. Исследование молекулярных основ этих процессов необходимо как для семакс 1 процентный инструкция механизмов высших функций головного мозга, включая обучение и запоминание, так и для семакс 1 процентный инструкция способов воздействия на патологические состояния нервной системы. В семакс 1 процентный инструкция с этим актуальным является поиск изучение механизмов действия факторов, влияющих на эти процессы. Таким образом, меланокортины проявляют интересный комплекс свойств, одновременно включающий ноотропные и нейротрофические активности. Наличие данных свойств в совокупности со способностью проникать через гемато-энцефалический барьер делает данное пептидное семакс 1 процентный инструкция перспективным с точки зрения медицинского применения. Более того, Семакс является в настоящее время единственным индивидуальным пептидом, применяемым в клинике как ноотропное и нейропротекторное средство. При исследовании активности Семакса в экспериментах на животных была обнаружена его способность стимулировать процессы обучения, внимания и запоминания, что нашло в дальнейшем подтверждение в клинических испытаниях Семакса, выявивших его способность влиять на эти процессы и у человека. Кроме того, практически неизвестны гены, экспрессия которых регулируется меланокортинами при осуществлении ими нейроактивных свойств. В связи с этим представляется важным изучение молекулярных механизмов действия Семакса и как клинически применяемого ноотропного и нейропротекторного препарата, и как представителя пептидного семейства меланокортинов. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Целью работы являлось изучение молекулярных механизмов ноотропного и нейропротекторного действия Семакса, включая поиск и характеризацию связывающих центров Семакса на плазматических мембранах мозга крысы и поиск ядерных мишеней действия данного пептида на клетки мозга крысы. Основные задачи исследования состояли в следующем: 1. Получить данные относительно существования связывающих центров Семакса на плазматических мембранах мозга крысы. Изучить основные характеристики связывания Семакса: специфичность, зависимость от времени, обратимость, аффинность и концентрацию связывающих центров. Изучить деградацию Семакса в присутствии плазматических мембран и культур клеток нейроглии семакс 1 процентный инструкция нейронов базальных ядер переднего мозга крысы. Изучить влияние Семакса на выживаемость нейронов различной эргичности, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы. Проверить гипотезу о регуляции Семаксом экспрессии нейротрофинов или их рецепторов в клетках ЦНС как промежуточной стадии его нейропротекторного действия ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Пептидное семейство меланокортинов. Меланокортины являются семейством нейропептидов, принадлежащим к группе так называемых стрессовых пептидов, продуцирующихся с помощью протеолиза из молекулы-предшественника проопиомеланокортина ПОМК. Проопиомеланокортин является источником нескольких интересных семейств нейропептидов рис. В свою очередь, N-концевые фрагменты АКТГ, представляющие первые 13 аминокислот последовательности АКТГ, лишены способности стимулировать адренокортикальную секрецию. Последовательность АКТГ 1-13 соответствует а-меланоцитстимулирующему гормону а-МСГструктура которого идентична для всех позвоночных, в отличие от 3- и у-МСГ. Пептиды с аминокислотными последовательностями, входящими в последовательность а-МСГ, получили название меланокортины, или МСГ-пептиды. Наиболее длинный представитель меланокортинов - а-МСГ -изначально был известен как соединение, стимулирующее синтез меланинов и увеличение размеров и количества пигментных клеток в кожных покровах. Следует отметить, что короткие представители меланокортинов, включая аналоги, лишены не только способности стимулировать адренокортикальную секрецию, но и пигментстимулирующей способности, то есть семакс 1 процентный инструкция меланокортинов большей частью проявляются в отношении нервной системы. Тем не менее, исторически сложившееся название меланокортины будет употребляться и далее в смысле семейства пептидов с аминокислотными последовательностями, родственными фрагменту АКТГ 1-13 рис. Минимальным эндогенным меланокортином считается пептид АКТГ 4-10. Структура меланокортинов и некоторых их аналогов. Начиная с 60-х годов благодаря работам В 1950-60-х годах было показано, что АКТГ обладает не семакс 1 процентный инструкция к тому времени хорошо изученными эндокринными эффектами, но и способностью влиять на поведение. Эти данные позволили придти к выводу, что АКТГ и меланокортины являются эндогенными по отношению к мозгу соединениями, и центральная нервная система семакс 1 процентный инструкция только служит мишенью для этих пептидов, но и может сама продуцировать их. Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих. Проблема места синтеза меланокортинов. Нормальный и поврежденный мозг. Иммунохимическая локализация меланокортинов в основном проводилась с использованием антител к а-МСГ и АКТГ 4-10. Наибольшая концентрация а-МСГ обнаружена в гипоталамусе, а в пределах гипоталамуса - в аркуатном ядре. В остальных отделах мозга концентрация а-МСГ на 1 - 2 порядка ниже Таблица 1. Семакс 1 процентный инструкция, что отростки нейронов аркуатного ядра гипоталамуса проникают в другие отделы мозга, можно предположить, что источником а-МСГ для них служит именно аркуатное ядро. Другим источником служит аркуатное ядро, что не исключает возможности синтеза а-МСГ и других меланокортинов в остальных отделах мозга. В ходе эмбрионального развития ПОМК детектируется в гипоталамических нейронах эмбриона крысы начиная со срока 12 дней, в то время как в гипофизе иммунореактивность к ПОМК регистрируется лишь начиная с 15 - 16-го дня эмбрионального развития. Впервые ПОМК появляется в аркуатном ядре на сроке 10. В этот же срок ПОМК детектируется в нервных волокнах латерального и дорсального диэнцефалона. К этому же сроку ПОМК-содержащие нейриты обнаруживаются в миелэнцефалоне. Следует отметить, что ПОМК-содержащие клетки в гипофизе появляются позже, чем в аркуатном ядре к 12. Имеются данные о том, что в мозге эмбрионов мыши процессинг ПОМК с образованием а-МСГ начинается со срока 11. Интересно, что у больных болезнью Альцгеймера концентрация этого пептида в черной субстанции существенно снижена. Объяснения этому феномену пока не предложено. АКТГ 4-10 был иммунохимически обнаружен в мозге взрослой крысы только в волокнах аркуатного ядра и средней септальной области. Совершенно иная ситуация с распределением АКТГ 4-10 возникает при исследовании неонатального то есть развивающегося мозга в нем АКТГ 4-10 обнаруживается как в аркуатном ядре и средней септальной области, так и в стриатуме, коре, гиппокампе, перивентрикулярной области. Вопрос о происхождении АКТГ 4-10 практически не освещен в доступной литературе; по-видимому, постулируется его протеолитическое выщепление из а-МСГ, семакс 1 процентный инструкция что указывает и похожее распределение этих пептидов в мозге. Таким образом, из данных по экспрессии АКТГ 4-10 в мозге крысы следует, что, по-видимому, значение этого меланокортина в функционировании взрослого мозга весьма ограничено. Значительно более широкое распространение АКТГ 4-10 в неонатальном мозге свидетельствует о его роли в развитии центральной семакс 1 процентный инструкция системы, а появление АКТГ 4-10 в отделах поврежденного мозга по крайней мере, в рамках нигростриатной системы мозга указывает на вероятное участие АКТГ 4-10 в процессах регенерации центральной нервной системы. Общие трофические свойства меланокортинов. Наряду с семакс 1 процентный инструкция поведенческих и мнестических ноотропных эффектов меланокортинов происходило накопление данных о трофических эффектах меланокортинов. Подобные эффекты не наблюдались в случае постнатального развития. Таким образом, а-МСГ проявляет общие трофические свойства лишь семакс 1 процентный инструкция стадии эмбрионального развития организма. Другие исследованные меланокортины АКТГ 4-10 и Org 2766 не обладают столь глобальными трофическими активностями. Влияние меланокортинов на нейроны ЦНС. Большую ценность для изучения нейротрофических активностей представляют исследования на моделях in vitro. Существуют данные о влиянии меланокортинов на нейроны, полученные на этих моделях. Ноотропные и нейропротекторные эффекты меланокортинов. Открытие и клонирование пяти различных подтипов меланокортиновых рецепторов МС1-МС5 открыло новые возможности для разработки лекарств, которые могли бы быть использованы для лечения процессов воспаления, ожирения, анорексии, наркотической зависимости, половых дисфункций и др. Большинство семакс 1 процентный инструкция, мишенями для которых служат МС-рецепторы, являются аналогами а-МСГ. Механизмы ноотропных эффектов меланокортинов до настоящего времени окончательно не выяснены; вероятно, они не опосредованны через известные к настоящему времени типы МС-рецепторов. Изучение нейротропной активности фрагментов АКТГ, проведенные как в нашей стране, так и за рубежом, позволили выявить зависимость эффектов пептидов от их структуры, дозы и времени введения. На основании проведенных экспериментов были сделаны следующие выводы: - фрагменты АКТГ 4-75-10 и 4-10 ускоряют выработку условных рефлексов у экспериментальных животных. АКТГ 5-7 не оказывает влияния на обучение животных. Наиболее активным из исследованных пептидов оказался АКТГ 4-10. Положительный эффект пептидов был более выражен в том случае, когда в опытах участвовали люди с исходно плохой памятью или пожилые семакс 1 процентный инструкция с ослабленными познавательными способностями. Таким образом, многочисленные эксперименты показали принципиальную возможность создания на базе фрагментов АКТГ семакс 1 процентный инструкция препаратов, однако для разработки лекарственного средства на их основе необходимо семакс 1 процентный инструкция найти способ пролонгации их эффектов. Первые попытки создания лекарств на основе фрагментов АКТГ относятся к началу 1970-х годов. Путей для увеличения эффективности регуляторных пептидов существует несколько. Один из них - замена природных левовращающих L-аминокислот в молекуле пептида на правовращающие D- аминокислотные остатки или на остатки неприродных аминокислот с целью повышения устойчивости пептидов к действию протеаз. Так, замена Met4 в последовательности АКТГ 4-9 на сульфоксид метионина, Arg8 на D-Lys, а Тгр9 на Phe привела к разработке нового пептида ORG 2766, который во много раз более активен, чем АКТГ 4-10в тесте на угашение семакс 1 процентный инструкция избегания, причем направленность действия этого пептида на сохранение навыка зависит от дозы - введение малых доз 0. Препарат ORG 2766 не проявляет семакс 1 процентный инструкция и стероидогенной активности, не приводит к мобилизации липидов из жирового депо и не обладает опиоидной активностью. Также показано мощное нейропротекторное действие ORG 2766 после токсического воздействия 6-OHDA на нигростриатум. Ряд структурных изменений, в том числе замена С-концевой С ООН-группы, позволил получить два новых аналога фрагментов АКТГ -НОЕ 427 и ORG 31433, которые оказались в 10-100 раз мощнее, чем ORG 2766. В малых дозах эти пептиды семакс 1 процентный инструкция выработку условных рефлексов, в больших - затормаживают процесс выработки навыка. НОЕ427 более устойчив к действию протеаз, чем ORG 2766, обладает большей липофильностью и, вероятно, поэтому более эффективен по сравнению с другими синтетическими аналогами при исследовании семакс 1 процентный инструкция и способности к обучению. Был синтезирован исследован еще один аналог АКТГ 4-10 -BIM-22015. Изучение влияния этого пептида на фоне повреждения фронтальной коры показало, что животные, получавшие BIM-22015 в течение 20 дней после операции, не отличались по уровню обучаемости от ложнооперированных в тесте водный лабиринт. Также исследовались долговременные эффекты хронического введения BIM-22015, когда инъекции препарата прекращали за 30 дней до начала обучения. Ноотропные и нейропротекторные эффекты Семакса. В Институте молекулярной генетики РАН синтезирован пептид, имеющий структуру Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro. Эта последовательность была выбрана для создания лекарственного препарата и получила название "Семакс" семь аминокислот. Проведено семакс 1 процентный инструкция влияния Семакса на выработку пищедобывательного рефлекса на место в Т-образном лабиринте и сравнение эффектов этого пептида с эффектами фрагмента АКТГ 4-10. Было показано, что внутрибрюшинное введение Семакса в дозе 0. Ежедневное введение Семакса за 1 час до сеанса обучения также значимо ускоряло процесс выработки навыка, в то время как инъекция АКТГ 4-10 за 1 час до сеанса обучения была неэффективна. Более того, введение Семакса в дозе 0. Изучение влияния различных доз Семакса на обучение животных в Т-образном лабиринте показало, что введение препарата в дозах 0. Снижение дозы препарат до 0. Введение Семакса в дозе 0. Следовательно, увеличение дозы препарата не приводит к реверсии его эффектов в отличие от таких аналогов семакс 1 процентный инструкция АКТГ, как ORG 31433 и НОЕ 427. Изучено влияние Семакса на обучение животных в тесте с отрицательным подкреплением. В качестве модели такого обучения использовался тест выработки условного рефлекса пассивного семакс 1 процентный инструкция УРПИ. Исследование влияния Семакса на выработку УРПИ показало, что введение пептида в дозе 0. Было исследовано влияние Семакса на сохранение навыка пассивного избегания у крыс после электрошока. Семакс вводили перед проверкой сохранения навыка в дозе 0. В группе животных, которым вводили Семакс и не подвергали электрошоку, наблюдается значимое снижение времени пребывания в затемненном отсеке экспериментальной камеры в котором крысы получали болевое раздражение во время обучения по сравнению с контрольной группой. Электрошок вызывает угасание ранее выработанного навыка пассивного избегания у контрольных животных. Инъекция Семакса перед проверкой сохранения рефлекса животным, перенесшим электрошок, приводит к частичному восстановлению навыка, т. Было проведено изучение эффективности интраназального способа введения Семакса в организм. Показано, что ежедневное интраназальное введение пептида в дозе 0. Следовательно, при интраназальном введении Семакс был также эффективен, как и при внутрибрюшинном. Было изучено наличие у Семакса антигипоксических свойств. В первой серии опытов проводилось исследование влияния Семакса на устойчивость животных к условиям гипобарической гипоксии. Эксперименты показали, что однократное внутрибрюшинное введение Семакса в дозе 0. При хроническом введении пептида интраназально в течение 7 дней в дозе 0. Целью следующей серии экспериментов явилось исследование влияния Семакса на устойчивость крыс к циркуляторной гипоксии. В экспериментах была использована методика двусторонней окклюзии общих сонных артерий, которая является адекватной экспериментальной моделью тяжелого ишемического инсульта. Было показано, что инъекция Семакса внутрибрюшинно в дозе 0. Таким образом, можно заключить, что введение Семакса способствует уменьшению тяжести клинических проявлений экспериментального ишемического инсульта, вызванного двусторонним закрытием обеих общих сонных артерий. Проводилась оценка влияния Семакса на семакс 1 процентный инструкция нарушения памяти в эксперименте на крысах. Моделью клинической смерти являлась внезапная остановка общего кровообращения при пережатии сосудистого пучка сердца. Эксперименты показали, что ежедневное интраназальное введение Семакса в дозе 0. Проведенное исследование поведенческих эффектов аналогов АКТГ 4-10 и Семакса с отщепленным N-концевым метионином показало, что АКТГ 5-10 и Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro обладают нейротропной активностью. Однако, если в природном фрагменте отщепление метионина приводит к резкому падению активности, то образующийся при деградации Семакса гексапептид улучшает обучение животных эффективнее, чем Семакс. На основании проведенного исследования было сделано заключение о том, что продукты ферментативной деградации АКТГ 4-10 и Семакса обладают собственной нейротропной активностью и являются синергистами АКТГ 4-10 в отношении воздействия на процессы обучения. Следовательно, наблюдаемые семакс 1 процентный инструкция введении этих пептидов эффекты могут быть результатом действия как исходного гептапептида, так и его производных. При этом высокая активность и относительная устойчивость гексапептида Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro может в значительной степени обеспечивать длительное действие Семакса. Многочисленные исследования нейротропной активности Семакса, проведенные на животных, позволили сделать следующие выводы: - введение Семакса ускоряет обучение животных в тестах с различным знаком подкрепляющего раздражителя. Сопоставление клинической динамики в группе с применением Семакса и без нее обнаружило достоверное улучшение восстановительных процессов семакс 1 процентный инструкция фоне лечения Семаксом у больным со среднетяжелым и тяжелым инсультом. При ишемическом инсульте средней тяжести с преобладанием очаговых неврологических симптомов эффективность Семакса проявлялась с первых суток заболевания и выражалась в общей активизации больных и ускорении регресса очаговой симптоматики. У 88% больных, получавших Семакс, течение инсульта семакс 1 процентный инструкция регредиентным со стабильным регрессом неврологических нарушений, что значительно превышало аналогичный показатель в контрольной группе 55. При тяжелом инсульте применение Семакса в первые часы и дни заболевания позволило достоверно ускорить регресс не только очаговых, но и общемозговых и вегетативных симптомов. У всех больных, поступивших в состоянии оглушения, к концу вторых суток вернулось ясное сознание. К пятым суткам инсульта у 80% больных расстройство сознания и менингеальные симптомы полностью исчезли. У 80% больных, получавших Семакс, определялось регредиентное течение заболевания против 62% в контроле. В группе с применением Семакса летальность при тяжелом инсульте составила 10%, тогда как в контрольной группе - 28. Применение Семакса наиболее эффективно при каротидном ишемическом инсульте, хотя положительные эффекты препарата проявляются и при вертебрально-базилярной локализации сосудистого поражения. Изучение эффективности Семакса в зависимости от сроков начала терапии 2 - 5 ч или 6 - 12 ч от момента развития инсульта подтвердило преимущество раннего применения Семакса. При интраназальном применении в суточной дозе 12 - 18 мг препарат снижает 30-дневную летальность и улучшает клинический исход и степень функционального восстановления, особенно в случаях раннего начала терапии. В связи с выдвинутой нами гипотезой о возможном участии нейротрофинов в осуществлении действия меланокортинов, в частности Семакса, на ЦНС, и полученными нами свидетельствами о регуляции Семакс 1 процентный инструкция экспрессии нейротрофинов в головном мозге крысы, представляется необходимым в обзоре литературы отразить существующие в настоящее время данные об этом белковом семействе, и прежде всего о наиболее интенсивно изучаемом его представителе - нейротрофическом факторе мозга BDNF. Общая характеристика семейства нейротрофинов. Нейротрофины - семейство регуляторных белков нервной ткани, которые синтезируются нейронами и клетками нейроглии, и способствуют дифференцировке и поддержанию жизнеспособности и функционирования периферических и центральных нейронов. Семакс 1 процентный инструкция время эмбрионального развития нейротрофины способствуют выживанию периферических нейронов до и во время иннервации мишеней. Они функционируют также как физиологические сигналы выживания для центральных нейронов. При развитии нервной системы с помощью нейротрофинов регулируется выживаемость нейронов, то есть в зрелой семакс 1 процентный инструкция системе присутствуют те нейроны, которые в процессе развития нервной системы получили нейротрофины в надлежащем количестве от соответствующих клеток-мишеней. Нейротрофины регулируют нейрональную дифференцировку, индуцируют ветвление семакс 1 процентный инструкция арборизацию и рост аксонов спрутинг в направлении клеток-мишеней. В зрелой нервной системе нейротрофины регулируют как краткосрочную синаптическую передачу, так и долговременное потенцирование LTPучаствуя, таким образом, в обеспечении пластичности нервной системы, необходимой для ее нормального функционирования. Вариабельные домены определяют специфичность отдельных членов семейства. Нейротрофины связываются с двумя классами взаимодействующими друг с другом рецепторов - Trk-рецепторами рецепторы сопряженные с тирозинкиназой и Р75-рецепторами. В свою очередь, существуют подтипы Trk-рецепторов - TrkA наибольшая аффинность к NGFTrkB наибольшая аффинность к BDNF и NT-4 и ТгкС наибольшая аффинность к NT-3. При этом возможно связывание Trk-рецепторов и нейротрофинов в различных сочетаниях. В центральной нервной семакс 1 процентный инструкция ТгкА экспрессируется в основном холинергическими нейронами базальных ядер переднего мозга. Связывание нейротрофинов с рецептором приводит к его димеризации и активации тирозинкиназного домена. Кроме того, Р75 выполняет ряд семакс 1 процентный инструкция без участия Trk. В настоящее время можно констатировать, что рецепторы нейротрофинов образуют сложную и во многом пока не изученную систему, активация элементов которой приводит к различным семакс 1 процентный инструкция зачастую противоположным эффектам. К настоящему времени получены нокаутированные по генам всех нейротрофинов мыши, что дало дополнительные данные о роли нейротрофинов. В отличие от оценки развития периферической нервной системы нокаутированных по генам нейротрофинов животных, оценка развития центральной нервной системы оказалась более сложна; тем не менее в качестве общего вывода отмечено уменьшение количества нейронов в ряде отделов мозга. Экспрессия BDNF в нервной системе. В пределах гиппокампа интенсивно меченые нейроны семакс 1 процентный инструкция найдены в области пирамидного слоя, а семакс 1 процентный инструкция гранулярного слоя и ворот зубчатой извилины. Высокая экспрессия BDNF отмечена в нейронах коры мозга, ограде claustrum и других зонах. У крыс в возрасте одного месяца самый высокий уровень BDNF определяется в гиппокампе 5. В других областях уровень BDNF колеблется от 0. BDNF также в очень низких концентрациях обнаружен на периферии: 0. Вообще семакс 1 процентный инструкция головном мозге BDNF обнаружен во многих структурах, включая кору, миндалевидный комплекс, гиппокамп, ограду, некоторые ядра таламуса и гипоталамуса, черную субстанцию и некоторые образования ствола мозга. Эти данные указывают на наличие антероградного транспорта BDNF в определенных популяциях. В некоторых областях, наоборот, определяется только мРНК для BDNF. Так, в гиппокампе клеточные области, в которых определяется иммунореактивность BDNF, не совпадают с распределением мРНК. Как предполагается, это связано с тем, что количество белка слишком мало, чтобы семакс 1 процентный инструкция его с помощью имуногистохимии или же он очень быстро используется или транспортируется в другие области. TrkB экспрессируется на телах нейронов, на аксонах и дендритах во многих структурах, включая кору, гиппокамп, зубчатую извилину, стриатум, ядра перегородки, черную субстанцию, клетки Пуркинье мозжечка, ствол мозга, спинальные мотонейроны и чувствительные ядра ствола. Кроме семакс 1 процентный инструкция, TrkB обнаружен на субпопуляции клеток эпендимы, выстилающей желудочки мозга. Строение гена bdnf и регуляция семакс 1 процентный инструкция транскрипции. Кроме того, каждый из четырех вариантов, полученных в результате альтернативного сплайсинга, подвергается полиаденилированию по одному из двух сайтов, расположенных в 3' области экзона Таким образом, получается 8 продуктов, кодирующих один и тот же белок. Смысл подобного разнообразия, по-видимому, состоит в том, что экспрессия BDNF таким образом может селективно регулироваться различными факторами и на нескольких уровнях, что обеспечивает большую гибкость в контроле скорости и величине ответа на то или иное воздействие, приводящее к усилению экспрессии белка BDNF. Ген BDNF считается геном раннего ответа IEGто есть в ответ на стимул происходит быстрая инициация транскрипции этого гена, не требующая синтеза белка de novo, а в результате посттрансляционной модификации предсуществующих факторов семакс 1 процентный инструкция. Кальций, быстро связываясь с соответствующими белками, запускает каскады передачи сигнала в ядро клетки. В ядре, в промоторе гена BDNF транскрипционный фактор CREB, связанный с последовательностью CRE, находится в неактивном состоянии. Кальций-зависимые протеинкиназы фосфорилируют CREB по остатку Ser-133, что семакс 1 процентный инструкция транскрипцию мРНК для BDNF. Однако, мутационный анализ промотора BDNF выявил наличие дополнительных элементов, необходимых для кальций-зависимой транскрипции BDNF, отличных от CREB. Регуляторные последовательности, контролирующие транскрипцию, находятся обычно в последовательности ДНК, фланкирующей 5'-конец начального экзона. Для гена BDNF таких экзонов четыре. Транскрипты, содержащие I, II и III экзоны, экспрессируютя в мозге, тогда как IV экзон обнаружен вне мозга. Данные, полученные с помощью ОТ-ПЦР показали, что при деполяризации мембраны семакс 1 процентный инструкция нейронов коры in vitro происходит транскрипция, главным образом, III экзона. Причем этот процесс не останавливается при добавлении в культуру семакс 1 процентный инструкция, блокирующего синтез белка. Это позволило выявить наличие последовательности CRE за 35 bp до точки начала транскрипции. Дальнейший анализ промоторной области показал, что CREB является необходимым, но недостаточным фактором для запуска транскрипции. Найдены еще два элемента ДНК, регулирующие транскрипцию III экзона гена BDNF. Проксимальный элемент -52- -43 содержит последовательность E-box и связывает белок, принадлежащий к семейству транскрипционных факторов типа спираль-петля-спираль helix-loop-helix. Дистальный элемент -73 - -64 5-CTATTTCGAG-3' не принадлежит ни к одной из известных регуляторных последовательностей. С ним связывается белок, названный CaRF calcium response factor. Таким образом, III экзон гена BDNF находится под регуляцией трех различных последовательностей, зависящих от ионов кальция CaRE. Причем, мутация любого из них практически полностью прекращает транскрипцию BDNF, зависящую от ионов кальция. То есть, для запуска транскрипции требуется несколько сигнальных событий, семакс 1 процентный инструкция приведут к совместной активации всех трех факторов. Это, по-видимому, повышает порог сигнала, необходимого для запуска транскрипции BDNF, делая этот процесс более специфичным. К белкам, которые активируются автофосфорилированным Trk-рецептором, относятся фосфолипаза С1-у, адапторные белки She, rAPS и SH2-p, фосфатидилинозитол-3' киназа PI3KFyn, протеинтирозинкиназа, вовлеченная в регуляцию клеточной адгезии и синаптической пластичности и некоторые другие молекулы. Кроме того, как и все нейротрофины, Семакс 1 процентный инструкция связывается с Р75-рецепторами и, действуя через этот рецептор, может запускать программированную гибель клетки. Суточные колебания уровня BDNF. В течение суток уровень BDNF в мозге крысы испытывает значительные изменения. Семакс 1 процентный инструкция высокие концентрации BDNF мРНК отмечаются в ночные часы, и уровень в 20:00 выше уровня в 8:00 в 1. В гиппокампе наблюдались еще большие колебания: уровень BDNF мРНК в 20:00 выше, чем в 12:00 в семакс 1 процентный инструкция. То есть самые высокие семакс 1 процентный инструкция мРНК зафиксированы после выключения света 19:00а самые низкие -после включения семакс 1 процентный инструкция. Варьирует и экспрессия TrkB мРНК. Во фронтальной коре минимальный уровень наблюдался в 24:00, а максимальный - в 12:00 с разницей в 5. В гиппокампе минимум экспрессии TrkB мРНК отмечен в 18:00, а максимум - в 8:00 с разницей в 17. Авторы связывают эти вариации уровней мРНК с физиологическими колебаниями активности животных. Крыс декапитировали через временные промежутки в 6 часов 12:00, 18:00, 24:00, 6:00. Точки 12:00 и 18:00 соответствовали середине и концу неактивного периода, а точки 24:00 и 6:00 - середине и концу активного. В результате были выявлены эндогенные колебания мРНК для BDNF в пирамидных клетках СА1 и САЗ областей гиппокампа, а также в воротных семакс 1 процентный инструкция. Экспрессия BDNF мРНК низкая во время светлого цикла пассивный период и повышается во время темного цикла активный период на 180% в СА1, на 170% в САЗ, на 153% в воротахна 145% в зубчатой извилине относительно уровней в 12:00. Таким образом, регуляция экспрессии BDNF зависит от активности животного и реакции на средовые воздействия. Таким семакс 1 процентный инструкция, ночное увеличение уровня BDNF мРНК может быть связано с выбросом ацетилхолина. Не исключено, что разные факторы вносят свой вклад в суточные колебания экспрессии BDNF. Если это так, то колебания BDNF в коре и гиппокампе не являются истинным суточным ритмом, а отражают внешние воздействия, зависящие от времени суток. Напротив, в гипоталамусе, структуре, тесно связанной с генерацией суточных ритмов у млекопитающих, BDNF мРНК и белок колеблются ритмично в отсутствии сигналов "свет-темнота". Существуют указания в пользу того, что колебания уровня экспрессии BDNF могут вызываться колебаниями кортикостерона. Кортикостерон синтезируется ритмично в течение суток, достигая максимума с наступлением темноты, когда у крыс начинается период активности. В областях СА1 и САЗ колебаний экспрессии BDNF не обнаружено, в отличие от семакс 1 процентный инструкция, описанных семакс 1 процентный инструкция вышеуказанных исследованиях. При этом пик концентрации кортикостерона в плазме крови зафиксирован в 20:00, а минимум - в 8:00. Возможно, суточный ритм экспрессии BDNF в зубчатой извилине может регулироваться кортикостероном. После 3 часов сна, спонтанного бодрствования или лишения сна семакс 1 процентный инструкция в экспрессии BDNF мРНК в коре мозга обнаружено не было. Однако после 8 часов бодрствования экспрессия BDNF мРНК в коре была существенно больше, чем после 8 часов сна, независимо от того, было ли бодрствование спонтанным во время темного периода или же оно достигалось лишением сна в светлое время суток. Бодрствование вызывало увеличение экспрессии BDNF семакс 1 процентный инструкция и в других областях мозга, а именно, в гиппокампе и таламусе. Уровень белка BDNF в коре бодрствующих крыс в 1. Эти результаты дают основание предполагать, что поведение животного бодрствование в большей степени, чем время суток темный период отвечает за увеличение экспрессии BDNF мРНК. Факторы, влияющие на экспрессию BDNF в ЦНС. Краткие сведения о влиянии различных факторов на уровень BDNF в головном мозге представлены в Таблице 2 и следующих за ней комментариях. Влияние различных факторов на экспрессию BDNF в головном мозге. ВОЗДЕЙСТВИЕ ОТДЕЛ МОЗГА ЭФФЕКТ мРНК Белок 1. Известно, что уровни мРНК для BDNF и NGF зависят от активности нейронов. Это показано в экспериментах как in vitro, так и in vivo на семакс 1 процентный инструкция гиппокампа. Однократное введение физиологически активных, не вызывающих судороги доз этих препаратов вызвало увеличение уровней мРНК для BDNF и NGF на 200-400%, а уровней соответствующих белков на 200 - 250% в коре, гиппокампе и спинном мозге крыс. Во всех исследованных областях сначала повышалась концентрация белка NGF, а затем - BDNF. Максимальные концентрации обоих белков достигались через 24 - 72 часа, в зависимости от области. В отличие от этого, концентрация нейротрофина NT-3 в коре и гиппокампе снижалась на 50% относительно контрольных значений. Эти данные демонстрируют способность антагонистов ГАМК Б -рецепторов избирательно увеличивать уровни эндогенных нейротрофинов в ЦНС. В период раннего нейронального развития ГАМК функционирует как возбуждающий нейротрансмиттер. Такое действие ГАМК ведет к ряду изменений в структуре и функции нейронов. И ГАМК, и агонист ГАМК А рецептора мусцимол стимулируют экспрессию BDNF при раннем нейрональном развитии нейроны гипоталамуса, 5 дней in vitro. Электрофизиологические исследования клеток показали, что BDNF значительно увеличивает частоту возбуждающих ГАМК-ергических постсинаптических токов. Эти данные говорят о взаимосвязи ГАМК и BDNF в период раннего развития: ГАМК увеличивает экспрессию BDNF, a BDNF в свою очередь облегчает синаптический выброс ГАМК. После 4 часов инкубации нейронов с агонистами глютаматных рецепторов: квисквалат, каинат, AMP А альфа-амино-Згидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионат и NMDA, увеличивался уровень BDNF мРНК. Можно сделать вывод, что основной вклад в регуляцию экспрессии глютаматными рецепторами BDNF мРНК вносят именно метаботропные рецепторы. Половые стероидные гормоны, эстрогены и андрогены, влияют на организацию развивающейся нервной системы и участвуют в регуляции поведения взрослых особей. Эстрогены, как и нейротрофины, в ряде случаев способствуют выживанию и дифференцировке клеток нервной ткани. Таким образом, эстроген регулирует транскрипцию широкого набора генов. Эта последовательность расположена в 5'-конце V экзона, то есть экзона, кодирующего белок BDNF. Овариэктомированным животным вводили эстроген и анализировали уровень мРНК в коре и обонятельных луковицах. Уже через 4 часа после однократного введения эстрогена наблюдалось 2-2. Анализ уровня BDNF мРНК в гиппокампе после неонатальной гонадэктомиии и последующей заместительной терапией эстрогеном выявил значительное повышение уровня BDNF мРНК с 4 по 10 дни постнатального развития. Параллельно с этим наблюдалось снижение уровня белка BDNF. Возможно, BDNF, синтезируемый нейронами гиппокампа, транспортируется к определенным мишеням, таким, как базальные ядра, а эстроген каким-то образом влияет на этот транспорт. При этом наблюдалась прямая зависимость уровня мРНК для BDNF от расстояния, которое крысы пробегали в семакс 1 процентный инструкция колесе. Авторы полагают, что физическая активность способствует увеличению устойчивости мозга к повреждениям и защищает его от нейродегенерации, связанной со старением. Через 3 дня после адренэктомии уровни мРНК для NGF, BDNF и NT-3 значительно снижались в обоих отделах. Заместительная терапия дексаметазоном семакс 1 процентный инструкция уровни нейротрофинов до контрольных значений. Через 24 часа и 48 часов после введения последовало снижение уровней до 50% от контрольных значений. Уровень BDNF мРНК в семакс 1 процентный инструкция 10 часов после введения не изменялся, а через 48 часов снижался до 70% от контрольных значений. Эти данные указывают на то, что глюкокортикоиды регулируют РОССИЙСКАЯ i ГОСУДАРСТВЕННАЯ j БИБЛИОТЕКА 41 экспрессию мРНК нейротрофинов в коре и гиппокампе. В результате было семакс 1 процентный инструкция, что единичная или повторная иммобилизация приводит к значительному снижению уровней BDNF мРНК в гиппокампе и зубчатой извилине. В то же время уровень NT-3 мРНК в тех же областях в условиях хронического стресса увеличивается, а экспрессия мРНК для NT-4 и TrkB не менялась. Показано, что хроническое потребление этанола приводит к значительному снижению мРНК для BDNF в гиппокампе крыс, а уровень мРНК для NGF, NT-3, а также белка NGF остаются неизменными. В связи с этим возникает вопрос, принимает ли холинергическая система участие в экспрессии нейротрофинов в ЦНС. Холинергическая деафферентация гиппокампа, коры и обонятельных луковиц с помощью инъекции в желудочки 192 IgG- сапорина не вызвала значительных изменений уровней мРНК для NGF, BDNF и NT-3 в этих областях от 1 недели семакс 1 процентный инструкция 5 месяцев после повреждения. Никотин вызвал длительно сохраняющийся с 24 до 72 часов подъем уровня NGF мРНК во всех областях гиппокампа. Этот подъем зависел от передачи возбуждающих нейротрансмиттеров и блокировался применением антагонистов АМРА или NMDA рецепторов. В отличие от этого, карбахол и пилокарпин приводили к увеличению NGF мРНК сохранявшемуся 4-8 часов после введения. Пилокарпин приводил к значительному увеличению уровня BDNF мРНК в гиппокампе; никотин и карбахол проявляли ту же тенденцию. Никотин и карбахол вызывали семакс 1 процентный инструкция уровня NT-3 в зубчатой извилине и СА2. Через 8 часов после применения никотина происходил и подъем TrkB мРНК. Уровень TrkC мРНК не изменялся. Показано, что острое применение никотина значительно снижает уровень BDNF мРНК в зубчатой извилине, СА1 и САЗ областях гиппокампа крысы через 2 и 24 ч. Норадренергические нейроны locus coeruleus иннервируют несколько областей мозга, в том семакс 1 процентный инструкция гиппокамп и кору. Как известно, в гиппокампе отмечается самая высокая концентрация нейротрофинов NGF, BDNF и NT-3. Было показано, что химическое повреждение вызывало значительный подъем мРНК для NGF и BDNF в гиппокампе через 35 дней, не повлияв при этом на уровень мРНК для NT-3. Механическое же разрушение привело к значительно менее выраженным изменениям в уровнях нейротрофинов. Через 2 часа после введения предшественника дофамина, леводопа, возрастал уровень BDNF мРНК. Повышенный уровень сохранялся в течение 16 часов. Совместное введение галоперидола частично ингибировало этот эффект. Таким образом, дофаминергическая стимуляция напрямую семакс 1 процентный инструкция на экспрессию BDNF мРНК в стриатуме in vivo. Экзогенное введение NO приводило к снижению уровня белка BDNF на 46% семакс 1 процентный инструкция контроля. С другой стороны, при добавлении BDNF в культуру нейронов коры действует как положительный регулятор синтеза NO. У нокаутированных по bdnf мышей нарушена экспрессия NOS в коре. Экспрессия NGF и BDNF значительно увеличивалась под действием AVP 4-8 в коре и гиппокампе, а экспрессия NT-З не изменялась. Уровень NGF мРНК в коре увеличивался в 6. В гиппокампе были обнаружены соответствующие изменения - в 3. Применение в тех же условиях поведенчески активного AVP привело к незначительным изменениям уровня экспрессии BDNF, а его поведенчески неактивный аналог окситоцин вообще не вызвал изменений. При этом в культурах нейронов увеличение экспрессии BDNF мРНК, вызванная VIP и РАСАР, полностью отменяется под действием антагонистов NMDA-рецепторов - МК-801 и АР5, что указывает на то, что их действие связано с потенцированием действия глютамата. Таким образом, обращает на себя внимание то, что нейротрофины и, в особенности BDNF, являются важнейшими факторами выживаемости нейронов и в то же время мощными регуляторами функций ЦНС. При этом уровень экспрессии BDNF достаточно лабилен - регулируется и эндогенными факторами, и внешними условиями, в которых находится организм. Следует отметить также, что пептидная регуляция экспрессии BDNF изучена недостаточно, и к настоящему времени имеется лишь три пептида, для которых показана способность усиливать экспрессию BDNF в клетках мозга - AVP 4-8VIP и РАСАР, причем только на уровне транскрипции. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Использованные материалы и реагенты. В работе использовались следующие реагенты: L- глютамин, MEM, F12, DMEM, эмбриональная сыворотка коровы ICNсахароза, BSA, SDS, EDTA, NaOH, Na2C03, Na2HP04, NaCl, PPO, POPOP, бензамидин, PMSF, BDNF, Трис, инсулин, трансферрин, прогестерон, путресцин, Na2Se03, трифторуксусная кислота, гептафтормасляная кислота, трихлоруксусная кислота, ацетонитрил, полиэтиленимин, D-глюкоза, L-глютамин, апротинин, лейпептин Sigma, Sigma-AldrichCuS04, параформальдегид, Ca,Na-TapTpaT, соляная кислота, толуол РеахимСаС12, реактив Фолина Merckтритон Х-100 "Ferak Berlin". Использовалась пластиковая культуральная посуда фирм Nunc и Costar. Производители других использованных в работе материалов и реагентов указаны в соответствующих разделах. Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса. Синтез и мечение тритием гептапептида Семакс проводилось в ОХФАВ ИМГ РАН. Чистота препаратов проверялась методами тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ. Использовались препараты с чистотой не менее 98%. Немеченый Семакс хранился в виде 1 мМ раствора в воде стандарта чистоты MilliQ при -70°С. Стерильный раствор Семакса получали фильтрованием через 0. Растворы Семакса после размораживания хранили при 4°С использовали в течение 6 часов. В качестве контролей использовали эквивалентный объем воды стандарта чистоты MilliQ. Выделение плазматических мембран мозга. Крыс линии Вистар самцы массой 200-250 г декапитировали, извлеченные базальные ядра переднего мозга промывали PBS 10 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCI, рН 7. Гомогенизацию и все последующие операции проводили при температуре 4°С. Гомогенат центрифугировали в течение 20 минут семакс 1 процентный инструкция 1000 g, семакс 1 процентный инструкция отбрасывали, а супернатант подвергали повторному центрифугированию при 40000 g в течение 30 минут. Плотный коричневый осадок на семакс 1 процентный инструкция пробирки, обогащенный митохондриями, отбрасывали, а менее плотный светлый осадок суспендировали в буфере А, переносили в чистую пробирку и дважды промывали этим же буфером, осаждая мембраны центрифугированием, аналогичным предыдущему. По окончании промывок осадок суспендировали в 10 мМ Трис-HCl, рН 7. Для каждой экспериментальной точки использовали по 8 параллелей. После инкубации 20 минут при семакс 1 процентный инструкция температуре добавлялось по 40 мкл реактива Фолина, разведенного в 5 раз дистиллированной водой. Семакс 1 процентный инструкция каждой стадии пробы тщательно перемешивались. Не менее чем через 90 минут инкубации при комнатной температуре измерялась оптическая плотность при 490 нм. Эксперименты по связыванию гептапептида Семакс с плазматическими мембранами проводили в 3. Реакцию начинали добавлением 0. Пробирки переносили в шейкер-инкубатор и выдерживали соответствующее время при температуре 30°С при постоянном перемешивании. Каждую пробирку промывали один раз холодным 50 мМ Трис-НС1 рН 7. Фильтры сушили на воздухе и переносили в сцинтилляционные флаконы, содержащие 5 мл сцинтилляционной смеси 4 г РРО, 0. Радиоактивность определяли на сцинтилляционном счетчике "Mark-3" Nuclear Chicago, США с эффективностью около 30%. Неспецифическое связывание определяли как количество метки, не вытесняемое 10 мкМ немеченым пептидом. Обратимость связывания с мембранами выявляли путем вытеснения связавшейся метки избытком немеченого Семакса в среду инкубации добавляли 10 мкл 1 мМ немеченого пептида до конечной концентрации 10 мкМ. Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур. Плотность посева клеток соответствовала указанному семакс 1 процентный инструкция разделе "Получение и ведение первичных клеточных культур". После инкубации указанное время в СОг-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг и 95% воздуха, инкубационную смесь отбирали, кипятили в течение 2 минут, охлаждали до 4°С и центрифугировали при 4°С 15 минут при 15000 g. Супернатанты хранили при -20°С. В случае плазматических мембран реакционная смесь содержала 1 мМ СаС12 в 50 мМ Трис-HCl буфере рН 7. Реакцию начинали добавлением мембранного белка до концентрации 0. Пробирки переносили в шейкер-инкубатор и выдерживали соответствующее время при температуре 30°С при постоянном перемешивании. В указанные промежутки времени из инкубационной смеси отбирали аликвоты объемом 400 мкл в полипропиленовые микропробирки Eppendorfинкубировали 2 минуты при 100°С и центрифугировали при семакс 1 процентный инструкция 15 минут при 15000 g. Супернатант отбирали и хранили при -20°С. Для определения семакс 1 процентный инструкция Семакса и его фрагментов в биологических пробах проводили экстрагирование пептидной фракции образцов с помощью органических растворителей, с последующей ВЭЖХ полученных экстрактов. К образцу 200 мкл прибавляли 4-кратный объем ацетонитрила. Смесь центрифугировали при 4°С 15 минут при 12000 g. Отбирали супернатант и высушивали его в роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в 1 мл метанола. Центрифугировали при тех же условиях, супернатант снова высушивали в роторном испарителе, сухой остаток растворяли в 100 мкл дистиллированной воды. Разделение меченных тритием Семакса Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro и его фрагментов Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, His-Phe-Pro-Gly-Pro, Phe-Pro-Gly-Pro, Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly, Met-Glu-His-Phe-Pro и His-Pro-Gly-Pro из полученных образцов проводили методом ВЭЖХ со спектрофотометром Beckman при длинах волн 220 и 254 нм, колонкой "Kromasil" 4x150 ммзернение 5 мкм при 20°С. Полученные образцы смешивали с внутренними контролями - немечеными Семаксом и его метаболитами по 5 мкг каждого пептида и подвергали градиентному элюированию в смеси А 0. С помощью жидкостного сцинтилляционного счета рассчитывали содержание радиоактивности в объеме элюэнта, соответствующем каждому из разделяемых пиков. Получение семакс 1 процентный инструкция ведение первичных клеточных культур. Первичную культуру клеток нейроглии рис. Крыс линии Sprague-Dowly возраста 1-3 дня забивали с помощью углекислотной асфиксии 15 минут и помещали на 1 минуту в 80% раствор этанола в воде. Далее все операции проводили в асептических условиях при температуре 4-7°С. Выделенный мозг помещали в раствор Хэнкса и далее выделяли базальные ядра переднего мозга, освобождая ткань от оболочек. Ткань диссоциировали на отдельные клетки механически с помощью пипетирования. Полученную клеточную суспензию один раз промывали средой того же состава с помощью центрифугирования при 200 g. Клетки считали в гемацитометре камера Горяева и засевали плотностью 200 тыс. Культуральную среду меняли каждые 3-4 дня. Пересев клеток проводили после достижения монослоя в соотношении 1:3. Для экспериментов использовали полученные после третьего пересева клетки по достижении монослоя. Первичные диссоциированные культуры нейронов базальных ядер переднего мозга крысы рис. Крыс линии Sprague-Dowly массой 200 - 300 г ссаживали в соотношении 1 самец - 3 самки после 18 часов вечера; следующий день после рассаживания считался первым днем беременности. Крыс умерщвляли методом углекислотной асфиксии 15 минут семакс 1 процентный инструкция помещали на 1 минуту в 80% раствор этанола в воде. Далее все операции проводили в асептических условиях при температуре 4 - 7°С. Выделенный из эмбриона мозг помещали в раствор Хэнкса и далее выделяли базальные ядра переднего мозга, освобождая ткань от оболочек. Ткань диссоциировали на отдельные клетки механически с помощью пипетирования. Полученную клеточную суспензию два раза промывали средой с помощью центрифугирования. Клетки считали в гемацитометре камера Горяева и засевали плотностью 100 тыс. Культивирование клеток проводили в С02-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02 и 95% воздуха. Оценка выживаемости нейронов in vitro. Культивирование первичных культур нейронов проводили в 12-луночных планшетах в 6 параллелях для каждого варианта. Выживаемость культивируемых нейронов через 7 дней культивирования оценивали путем подсчета цитохимически или иммуноцитохимически окрашенных клеток в 18 случайных полях каждой лунки. Использовались реактивы Sigma, США. Холинергические нейроны визуализировали с помощью окраски на ацетилхолинэстеразу. Культуры фиксировали 4% параформальдегидом 1 час при комнатной температуре, промывали PBS инкубировали 48 часов в 50 мМ ацетатном буфере рН 5. Затем инкубационную среду отбирали, клетки промывали водой и на 1 - 2 семакс 1 процентный инструкция добавляли 1. Среду отбирали и на 1 - 2 минуты добавляли 1% Рис. Культивируемые клетки нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы фазовый контраст, ув. Среду отбирали, и планшеты промывали водой. Тотальную общую популяцию нейронов визуализировали с помощью антител к нейронспецифической энолазе NSE. Клетки фиксировали 1 час при комнатной температуре 4% параформальдегидом, промывали PBS, инкубировали 15 минут в PBS, содержащем 33% овечьей сыворотки, и затем 1 час в PBS, содержащем 0. Лунки промывали PBS инкубировали 1 час с биотинилированными анти-кроличьими антителами разбавление в PBS 1:500 и визулизировали семакс 1 процентный инструкция с помощью набора ABC reagent Vectastain. ГАМК-ергические нейроны визуализировали с помощью антител семакс 1 процентный инструкция ГАМК. Клетки фиксировали 4% семакс 1 процентный инструкция 1 час при комнатной температуре, промывали PBS инкубировали 1 час в PBS, содержащем 7% сахарозы. После семакс 1 процентный инструкция раствор отбирали, добавляли раствор аналогичного состава, замораживали при -76°С и размораживали при комнатной температуре. Клетки затем инкубировали 10 минут в PBS и затем 10 минут в PBS, содержащем 5% овечьей сыворотки и 0. Среду отбирали, и клетки инкубировали с кроличьими антителами к ГАМК разбавление 1:1000 в PBS с 5% овечьей сыворотки. Лунки промывали PBS инкубировали 1 час с биотинилированными семакс 1 процентный инструкция вторыми антителами разбавление в Семакс 1 процентный инструкция 1:500 и визулизировали клетки с помощью набора ABC reagent Vectastain в соответствии с методикой семакс 1 процентный инструкция рекомендациями производителя. Культивируемые клетки нейронов базальных ядер переднего мозга крысы иммуноцитохимическая окраска на NSE, ув. Оценка уровня пролиферации клеток. Клетки высевали на 24-луночные планшеты плотностью 100 тыс. Затем культуральную среду отбирали, добавляли на 10 минут метанол, высушивали на воздухе, семакс 1 процентный инструкция раза промывали PBS 4°С и 3 раза по 10 минут промывали 10% раствором трихлоруксусной кислоты 4°С. Клетки лизировали в 200 мкл раствора 1% SDS и 0. Определение уровня BDNF в отделах мозга крысы in vivo. Использовали самцов крыс линии Вистар, массой 300-350г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище и 12-ти часовым циклом освещения включение света в 9:00, выключение - в 21:00. Были созданы все условия для минимизации стрессирования животных. Животных содержали в клетках по 6 штук, таким образом, что каждая клетка содержала представителей и контрольных, и экспериментальных животных. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. В каждой группе было по 4 животных. В указанные промежутки времени крыс забивали декапитацией, и сразу после этого выделяли исследуемые отделы мозга. Ткань замораживали в жидком азоте и затем хранили при -70°С. Для получения белковых экстрактов ткань взвешивали, помещали в экстракционный буфер рН 7. Гомогенаты центрифугировали 30 минут при 4°С при 15000g, отбирали надосадочную жидкость и полученные экстракты хранили при -70°С. Концетрацию белка в экстрактах определяли с помощью модифицированного метода Лоури. Определения семакс 1 процентный инструкция BDNF в экстрактах проводили с использованием набора BDNF Emax® Immunoassay System "Promega", СШАследуя методике и рекомендациям производителя. Оценка уровня экспрессии мРНК нейротрофинов в культуре нейроглии. Через 48 часов в среду вносили 50 мкл стерильного раствора Семакса до указанной конечной концентрации или эквивалентный объем семакс 1 процентный инструкция воды. В указанные промежутки времени культуральную среду отбирали и клетки промывали PBS семакс 1 процентный инструкция. Тотальную РНК выделяли фенол-хлороформной экстракцией с использованием набора Promega RNAgents® Total RNA Isolation System Promegaследуя методике и рекомендациям производителя. После этанольного осаждения осадок РНК дважды промывали 70% этанолом и хранили при -70°С. Для удаления возможной примеси геномной ДНК образцы РНК растворяли в обработанной диэтилпирокарбонатом DEPC воде инкубировали 1 час при 37°С в присутствии свободной от РНКаз ДНКазы. После дополнительной семакс 1 процентный инструкция экстракции РНК осаждали, промывали 70% этанолом, растворяли в обработанной DEPC воде и хранили при -70°С. Для проведения обратной транскрипции отбирали 2 мкг тотальной РНК и проводили реакцию 1 час при 37°С в 25 мкл среды, семакс 1 процентный инструкция 1 мкг oligo dT i5 праймеров, 50 мМ Трис-НС1, 15 мМ NH4 2S04, 5 мМ MgCl2, 0. После последующей инкубации 10 минут при 95°С, образцы кДНК хранили при -20°С. С полученными образцами кДНК амплификацию проводили семакс 1 процентный инструкция использованием следующих праймеров и условий: 3- актин 5 '-TTGTAACCACCTGGGACGATATGG-3' 5'-GATCTTGATCTTCATGG TGCTAG-3' 94°С - 1 минута, 61°С - 1 минута, 72°С - 1 минута BDNF 5 '-СAGTGGACATGTCCGGTGGGACGGTC-31 5'-TTCTTGGCAACGGCAACAAACCACAAC-3' 94°С - 1 минута, 72°С - 1 минута NGF 5-GGCGTACAGGCAGAACCGTACACAG-3' 5'-CCGTGGCTGTGGTCTTATCTCCAACCCACAC-3' 94°С - 1 минута, семакс 1 процентный инструкция - 1 семакс 1 процентный инструкция Амплификацию проводили в среде объемом 20 мкл, содержащей 2 мкл кДНК образца, 5 пмоль каждого праймера, причем один из каждой пары был мечен 32Р-уАТР с помощью Т4-полинуклеотидкиназы Силекс, Россия5 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTPs, 50 мМ Трис-НС1, 15 мМ NH4 2S04, 5 мМ MgCl2, 0. После начальной денатурации 5 минут при 94 °С, 2. Участки геля с визуализированными с помощью бромистого этидия продуктами амплификации вырезали, и определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике "Mark-3" Nuclear Chicago, США. Все образцы тестировались в трех параллелях. Полученные относительные количества продуктов для NGF и BDNF нормализовали по относительному количеству продукта для 3- актина. Оценка уровня экспрессии BDNF мРНК и TrkB мРНК in vivo. Использовали самцов крыс линии Семакс 1 процентный инструкция, массой 300-350 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище и 12-ти часовым циклом освещения включение света в 9:00, выключение - в 21:00. Были созданы все условия для минимизации стрессирования животных. Животных содержали в клетках по 6 штук, таким образом, что каждая клетка содержала представителей и контрольных, и экспериментальных животных. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. В каждой группе было по 4 животных. В указанные промежутки времени крыс забивали декапитацией, и сразу после этого выделяли исследуемые отделы мозга. Ткань помещали в консервирующий раствор EverFresh SOLID Клоноген, Россия и хранили при 4°С в течение 1 недели. К ткани с консервирующим раствором добавляли равный объем стерильного PBS рН 7. Тотальную РНК из образцов выделяли с помощью фенол-хлороформной экстракции с использованием набора PeqGold RNAPure PeqLab, Германияследуя методике и рекомендациям производителя. Полученную РНК дважды промывали 80% этанолом 4°С и растворяли в 40 мкл воды, свободной от РНКаз и хранили при -80°С. Содержание РНК измеряли спектрофотометрически, и далее использовали образцы, для которых соотношение оптических плотностей при 260 и 280 нм превышало 1. После последующей инкубации 10 минут при 95°С, образцы кДНК хранили при -20°С. После инкубации 7 минут при 72°С, продукты разделяли в 1% агарозном геле с визуализацией с помощью бромистого этидия. Качество образца определяли по наличию продукта величиной 249 bp при отсутствии продукта величиной 1100 bp, соответствующего геномной последовательности ГФРТ. Оценку уровня экспрессии BDNF мРНК проводили с использованием количественной ПЦР в реальном времени real-time quantitative PCR, система LightCycler, Roche Diagnostics. Применяли высокоспецифичный ёзДНК-связывающий краситель SYBR green Реакцию проводили в капиллярах из боросиликатного стекла в смеси объемом 10 мкл, содержащей 1 мкл кДНК образца или стандарта или 1 мкл воды негативная проба5 мкл Quantitect SYBR Green PCR Kit, 2. Для подтверждения специфичности продуктов амплификации после окончания амплификации образцы охлаждали до 65°С и через 15 секунд получали кривые плавления нагреванием до 95°С со скоростью 0. Все образцы тестировались в двух параллелях. Для получения калибровочных кривых продукты семакс 1 процентный инструкция BDNF и р-актин очищали с помощью QIAquic Qiagen spin columns и последовательным разбавлением водой, свободной от ДНКаз, получали стандартные растворы с известной относительной семакс 1 процентный инструкция соответствующего продукта. С использованием программного обеспечения производителя определяли номер цикла, соответствующий максимальному ускорению процесса амплификации, получали калибровочную кривую числа данных циклов от относительной концентрации продукта, и определяли относительную концентрацию семакс 1 процентный инструкция неизвестном образце с последующей нормализацией по Р-актину. Оценку уровня семакс 1 процентный инструкция TrkB мРНК проводили с использованием количественной ОТ-ПЦР с флуориметрической оценкой количества продукта амплификации. Проводили амплификацию с использованием праймеров к TrkB и р-актина в следующем режиме: старт - 5 минут 95°С, 22 цикла р-актин и 27 циклов Семакс 1 процентный инструкция включающих 30 секунд при 95°С, 45 секунд при 68°С, 45 секунд при 72°С, в среде объемом 20 мкл, содержащей 2 мкл кДНК образца, 20 пмоль каждого праймера, 0. Данные условия обеспечивали пропорциональность количества продукта амплификации от количества исходной кДНК. После инкубации 7 минут при 72°С, продукты разделяли в 1% агарозном геле с визуализацией с помощью бромистого этидия. Калибровочную кривую получали введением в реакцию кДНК известной относительной концентрации. С помощью системы Alphalmager2000 Alpha Innotech Corporation определяли интенсивность свечения соответствующего продукта в ультрафиолетовом свете, и с помощью программного обеспечения производителя получали значения исходных относительных количеств соответствующих кДНК и проводили семакс 1 процентный инструкция нормализацию относительно Р-актина. Оценка уровня экспрессии TrkB мРНК в культуре нейроглии. Через 48 часов в среду вносили 50 мкл раствора Семакса до указанной конечной концентрации или эквивалентный объем воды. Через 24 часа культуральную среду отбирали и промывали PBS 4°С. Выделение РНК, обратную транскрипцию и определение уровня экспрессии TrkB мРНК проводили аналогично описанному в предыдущем разделе. Результаты обрабатывались с помощью программ Jandel Scientific SigmaPlot и Statsoft Statisica. Достоверности различий групповых семакс 1 процентный инструкция оценивались с помощью дисперсионного анализа one-way ANOVA и Kruskal-Wallis ANOVA. На графиках представлены средние значения групп с учетом стандартной ошибки среднего Mean+SEMп - объемы групп. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ выводы 1. Деградация гептапептида Семакс в присутствии как плазматических мембран, так и культур клеток нейроглии и нейронов базальных ядер переднего мозга крысы происходит и с С- и с N-конца молекулы с доминирующим образованием пентапептидов. Обнаружено существование связывающих центров Семакса на плазматических мембранах базальных ядер переднего мозга крысы и получены их характеристики. Обнаружено селективное влияние Семакса на выживаемость холинергических нейронов базальных ядер переднего мозга крысы in vitro. Обнаружено увеличение под действием Семакса экспрессии нейротрофина BDNF и его высокоаффинного рецептора в первичных культурах нейроглии и в головном мозге крысы. Одним из механизмов нейропротекторного и ноотропного действия Семакса может являться регуляция экспрессии ряда нейротрофинов их рецепторов в головном мозге. Список опубликованных семакс 1 процентный инструкция по теме диссертации. Application of primary cultures of rat fetal neurons to the study of neurotrophic action of peptides. Griffits, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих. Rapid and efficient NGF and BDNF mRNA induction in the rat glial cell cultures upon АСТЩ4-10 analog "Semax" action. Гептапептид Семакс стимулирует экспрессию BDNF в семакс 1 процентный инструкция отделах мозга крысы in vivo. Связывание аналога АСТН- 4-10 -гептапептида семакс с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы и его биодеградация. Effects of a new behaviorally active ACTH analogue, Semax on cholinergic basal forebrain neurons. Исследование механизмов нейропротективного действия аналога АСТН 4-10 Семакса. АСТЩ4-10 analog Semax increases neurotrophin expression in vitro and in vivo. Аналог АКТГ 4-10 Семакс специфически связывается с плазматическими мембранами мозга крысы и увеличивает экспрессию нейротрофинов в клетках мозга in vitro и in vivo. Semax - an analogue of АСТЩ4-10 - stimulates BDNF expression in different areas of the rat brain. Avignon, France, 2004, ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в результате проведенной работы впервые показано существование связывающих центров для Семакса на плазматических мембранах мозга крысы. Получены характеристики связывания Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы. Изучена биодеградация Семакса в присутствии плазматических мембран и культур клеток нейронов и нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы. Обнаружено, что биодеградация Семакс 1 процентный инструкция происходит и с С- и с N-конца с семакс 1 процентный инструкция скоростью. Присутствие в Семаксе последовательности -Pro-Gly-Pro не приводит к преобладанию продуктов деградации с N-конца в присутствии исследованных объектов и основным процессом является образование пентапептидов. Обнаружено влияние Семакса на выживаемость холинергических нейронов базальных ядер переднего мозга крысы in vitro. Показано влияние Семакса на экспрессию нейротрофинов BDNF и NGF в клетках нейроглии базальных семакс 1 процентный инструкция переднего мозга крысы. Обнаружено влияние Семакса на экспрессию BDNF и его рецепторов в ряде отделов мозга крысы при интраназальном введении. На основании этих данных известных поведенческих эффектов нейротрофинов нами выдвинуто предположение о существовании у Семакса антидепрессантной активности. В совокупности, полученные данные расширяют представление о механизмах действия членов пептидного семейства меланокортинов их функциях в организме. Сформулирована гипотеза о возможной компенсаторной семакс 1 процентный инструкция N-концевых фрагментов АКТГ эндогенных меланокортинов в поддержании функций гиппокампа при стрессовых воздействиях на организм. Полученные семакс 1 процентный инструкция представляют научно-практический семакс 1 процентный инструкция в связи с тем, что регуляция экспрессии нейротрофинов их рецепторов в мозге рассматривается как один из перспективный путей воздействия на ряд патологических состояний ЦНС, связанных с дегенерацией и гибелью нейронов. Данные о влиянии Семакса на экспрессию нейротрофинов в мозге крысы позволяют предложить возможный механизм наблюдаемых ноотропных и нейропротекторных эффектов этого клинически применяемого пептида, что может найти применение при разработке новых пептидных фармакологических средств. Кроме того, полученные данные о регуляции Семаксом экспрессии нейротрофинов могут предоставить дополнительную информацию для дальнейших клинических исследований Семакса в целях расширения спектра показаний и противопоказаний его применения. Вместе с тем, остается практически неисследованным вопрос о природе связывающих центров для Семакса на клеточных мембранах и механизмах передачи сигнала от них внутрь клетки. Однако, полученные нами данные о регуляции Семаксом экспрессии нейротрофинов их рецепторов в клетках ЦНС могут быть использованы для изучения этой проблемы. Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Долотов, Олег Валентинович, 2004 год 1. Relation of adrenocortical activity and adaptive семакс 1 процентный инструкция 11 Psychosom. Mechanism of action of melanocortin peptides. Boca Raton: CRC Press, 1987. Pro-opiomelanocortin neuronal systems 11 Rev. Van der Neut Van der Neut NGF-mediated increase of choline acetyltransferase ChAT in the neonatal rat forebrain: evidence for a physiological role of NGF in the brain? A simplification of the protein assay method of Lowry et al. Manual of the Nervous System. Attention and executive deficits in Alzheimer's disease. Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций OCR. В связи с чем, в семакс 1 процентный инструкция могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет. Научная электронная библиотека disserCat — современная наука РФ, статьи, диссертационные исследования, научная литература, тексты авторефератов диссертаций. ООО "Научная электронная библиотека", г.

  Комментарии к новости 
 Главная новость дня Главная новость дня 
Запрос баланса ростелеком
Срок строительства керченского моста
87 элемент таблицы менделеева
Автобус 99 маршрут на карте
Требование к оформлению доклада
Красное и белое пенза каталог
Описание женского тела
Конспект занятия больше меньше
Цели и задачи строительства
 
 Эксклюзив Эксклюзив 
Расписание маршрутки 90
Сроки посева редиса
Huawei ws880 инструкция
573 маршрутка люберцы расписание
Самолет воронеж сочи расписание
Инструкция по прошивке phoenix
Шанель 5 описание аромата